ESPECIAL #11: REVERSE GENETICS: GENÉTICA INVERSA

Vamos allá con este tema, que a mí como estudiante me llama particularmente mucho la atención porque una vez logras hacerte una idea de lo que supone, marea el tan solo plantearse dónde estaremos con esto dentro de no tantos años como creemos. A ver si lo hago medianamente bien y nos enteramos todos, yo incluido, que hasta que lo he entendido para poder hacer el artículo, tela.

La genética inversa investiga la función biológica de un fragmento de ADN secuenciado o clonado alterándolo mediante mutación. Al contrario que la genética habitual, que a partir de una función conocida pretende averiguar qué secuencia genética se encarga de ella; la genética inversa averigua a partir de una secuencia ya conocida qué fenotipo produce (al revés, vamos). Por decirlo de algún modo, la genética inversa parte del gen responsable hasta llegar a la enzima defectuosa. Para ello, se provocan cambios en dicho ADN y se observan los efectos derivados. Se realizan mutaciones ya sean puntuales (de nucleótidos) o masivas (silenciar genes completos), para luego analizar con PCR.

Veamos ahora las técnicas más conocidas:

Mutagénesis aleatoria. Consiste en la obtención de librerías que contengan cientos de variantes de un mismo gen. Para ello, primero se clona el gen (una vez localizado el receptor de interés) y a continuación se introducen mutaciones al azar. Si estamos cambiando, entonces, la secuencia de bases, obtendremos del mismo modo secuencias aminoacídicas distintas, es decir, tendremos una librería con variantes de un mismo gen que codifiquen para múltiples proteínas.

Así, las distintas cepas que queramos obtener se basarán en la expresión del receptor según nuestro interés: sensibilidad a factores químicos, agentes físicos, a la presencia o no de ligandos y activadores…

Del mismo modo, tendremos también varios métodos para conseguirlo:

  • Cepas mutantes. La clonación se realiza en plásmidos, lo que permite una gran variedad de mutaciones pero disminuye el rendimiento, al ser posible acumular mutaciones en la propia cepa.
  • Mutagénesis insercional. Emplea transposones, que al añadir 5 codones al insertarse (15 bases) permite la expresión de cualquier gen.
  • DNA shuffling. Se mezclan librerías ya existentes con DNAsas, que se unen después por mecanismos de PCR.

– Mutagénesis dirigida. En un sitio concreto del ADN. De nuevo, al variar la secuencia de a.a. variará la función de la proteína a codificar. También puede modificarse el promotor de un gen, e inclusive pueden crearse genotipos nulos. Primero se sintetiza un ADN corto, con las bases de interés, que se incorpora a un ADN monocadena a tratar. A continuación, se extiende la copia con polimerasa y se introduce en una hospedadora para poder clonarlo. Creo que el año pasado ya vimos la PCR, que es el mecanismo más empleado, así que no me detengo. Si aún así hubiese aquí alguna confusión o error, o se trate de otro método, comentadlo. Existe una alternativa, la PCRi, qeu aumenta los flancos de la secuencia a tratar para facilitar la inserción.

– Fenocopia. Se basa en (a ver si me explico bien) la existencia de individuos con un fenotipo inducido por condiciones externas, que es idéntico al fenotipo de otro individuo pero que viene causado por su genotipo. Es decir:

Individuo A Genotipo A ——-> Fenotipo A

Individuo B Genotipo B ——–> Fenotipo A

Ambos poseen el mismo fenotipo A: el individuo A por su genotipo, y el B por causa ambiental. El mecanismo de reverse genetics aquí busca individuos con un gen inactivo, dando una línea de mutantes a estudiar. Dos formas: elevando los niveles de t-ARN, que disminuyen los de m-ARN y por tanto el gen no se expresa; o bien actuando sobre la propia proteína codificada.

Clonación posicional y funcional. La primera, basada en la localización cromosómica, buscando marcadores genéticos; la segunda, investigando los procesos bioquímicos involucrados en la expresión del gen.

* Ahora bien, en cuanto a la influenza, su continua variabilidad antigénica provoca que cada año tenga que reformularse vacunas trivalentes contra la gripe. Ya veaíamos que la naturaleza segmentaria del virus permite que se reensamble con otro, generando preparados tanto inactivos como atenuados.

La genética inversa propone, sin embargo, generar el virus de la influenza enteramente a partir de clonación de plásmidos, inyectando en las células apropiadas entre 8 y 12 plásmidos ADN que porten el RNA o el mARN del virión. Si puediera llevarse a cabo, aumentaría la producción de vacunas tantos inactivas como atenuadas, además de ser capaces de crear generaciones enteras de donantes atenuados por mutación directa de sus genes. Además, su control sobre pandemias al poder modificar o eliminar factores de la influenza especialmente virulentos, está claro.

Como siempre, comentarios, impresiones, preguntas, aclraciones (sobretodo, aclaraciones, jeje) en comentarios^^

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6 pensamientos en “ESPECIAL #11: REVERSE GENETICS: GENÉTICA INVERSA

  1. Gemma… Impresionante!!!! Anonadada me has dejado!!! MUY BIEN!!!! Efectivamente, se trata de manipular el material genetico para poder averiguar la funcion…

    Nosotros eso, lo hacemos todos los dias en el laboratorio… Ahora mismo construir un virus de influenza es muy facil… Como dice Gemma se trata solo de transfectar 8 plasmidos en una celula (cada uno de ellos lleva un segmento del virus de la gripe, que son 8) y…. en dos o tres dias… ya, se tiene el virus. Esto tiene un potencial increible, pues nos permite hacer en el laboratorio las mismas mutaciones que los virus van acquiriendo. Esto nos ayuda a entender el tropismo de los virus, por que por ejemplo un virus de caballo no se transmite a humanos, y cosas por el estilo. Con este sistema intentamos entender que genes o que mutaciones estan implicadas en patogenesis, por ejemplo.

    No os parece increible que podamos hacer virus en el laboratorio como queramos???? Existen muchos virus para los que ya hay genetica reversa y las posibilidades son infinitas….

    Asi reconstruimos el virus de la gran pandemia de 1918, que se cree que mato 40 millones de personas. El virus nunca se pudo aislar, pero si que logramos averiguar la secuencia a partir de cadaveres de Alaska, que debido a las bajas temperaturas no se descompusieron. A partir de los pulmones de estos cadaveres, con tecnicas de RT-PCR, y con mucha paciencia, se descubrio la secuencia del virus. Una vez que supimos la secuencia, se hizo el virus… y cuando lo construimos nos dimos cuenta, que realmente es uno de los virus mas patogenicos que hemos visto nunca. Aun no sabemos bien por que fue tan virulento, pero cada vez tenemos mas pistas. Por ejemplo, sabemos que solo dos amino acidos en la HA hacen que el virus se transmita o que no se transmita…. Os imaginais lo que son tan solo dos amino acidos para que un virus matara 40 millones de personas?

  2. Jeje, muchas gracias^^ no pasa nada, faltaría más… yo de hecho vengo con más dudas que preguntarte:

    – He intentado encontrar datos pero no he podido. ¿Por qué desapareció la gripe española? ¿Mutó a cepas menos mortales?

    – ¿Hasta qué punto la genética inversa ayuda a la hora de extender la efectividad de las vacunas? Es decir, ¿ya no sería necesario hacer nuevas combinaciones con la gripe anual circulante para vacunar?

    – ¿El origen de la gripe del 18 fue solamente una mutación aleatoria? ¿Ayuda la genética inversa a conocer las condiciones de su origen?

    Muchas gracias!!!

  3. La gripe del 18 fue mutando poco a poco como hacen los virus normales, entre otras cosas porque los que no se murieron desarrollaron inmunidad contra el virus, entonces, al encontrar presion inmune, otros virus se fueron seleccionando. Los estudios filogeneticos se encargan de eso.

    De momento no tenemos una vacuna 100% eficiente, asi que de momento hay que seguir haciendo combinaciones con las actuales. Una de las cosas que hace la genetica reversa es generar los virus mucho mas rapido, no esperar a que la reasocion que explique en otro apartado ocurra en huevos o celulas. La otra ventaja, es que la vacuna de gripe se crece en huevos, y a veces hay virus de gripe que no crecen bien en huevos. En este caso podemos manipular un poco la secuencia para conseguir que crezca bien en huevos.

    El origen de la gripe del 1918 es un poco controversial, pero todos los datos apuntan a que era un virus completamente aviar que salto a humanos…. Si hubo o no hospedadores intermedios no lo sabemos, y si fue algo que ocurrio de repente o poco a poco tampoco lo sabemos.

    La genetica reversa no ayuda a conocer el origen, pero ayuda a entender cualquier virus que estemos estudiando, porque lo podemos modificar casi a placer y hacernos preguntas que las modificaciones que hemos hecho nos pueden responder

  4. Pingback: ¡Segunda entrega de The Last Of Us! – Science Glitchers

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